甲哨唑(甲硝唑)是一種廣譜抗厭氧菌與抗原蟲藥物，常被非法添加到化妝品、消毒劑及動物源性食品中。使用甲哨唑檢測試劑盒進行快速篩查，必須嚴(yán)格執(zhí)行樣本前處理與加樣的標(biāo)準(zhǔn)操作程序(SOP)，以保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性與重復(fù)性。
一、適用范圍與原理概述?
本SOP適用于ELISA類甲哨唑競爭抑制檢測試劑盒，樣本類型包括畜禽組織勻漿、乳品、蜂蜜及部分化妝品膏霜基質(zhì)。原理為樣品中甲哨唑與酶標(biāo)物競爭結(jié)合抗體，抑制顯色反應(yīng)，通過測定吸光度值計算殘留濃度。
二、樣本前處理步驟?
樣品均質(zhì)與稱量?
組織樣品去除脂肪與筋膜，取代表性部位稱重(如5 g)，加入預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7.2)，比例通常為1:4(W/V)，高速勻漿后冰浴冷卻。
蛋白沉淀與提取?
加入適量乙腈或甲醇(如樣品體積1:2)，渦旋混勻，靜置10 min使蛋白變性沉淀；4℃、12,000 rpm離心10 min，收集上清液備用。
凈化與濃縮(視基質(zhì)而定)?
對高脂或色素干擾強的樣品(如蜂蜜、化妝品)，可采用固相萃取(SPE)C18柱凈化：活化—上樣—洗滌—洗脫，收集洗脫液并氮氣吹干，再用復(fù)溶液溶解至規(guī)定體積。
過濾與稀釋?
上清液或復(fù)溶液經(jīng)0.22μm濾膜過濾，按試劑盒說明書取一定量用樣品稀釋液稀釋至檢測范圍，避免超出標(biāo)準(zhǔn)曲線線性區(qū)間。
三、加樣流程?
試劑回溫與混勻?
將試劑盒從冷藏取出，平衡至室溫(20–25℃)，輕搖微孔板或試劑瓶使液體均勻，避免氣泡。
加樣順序?
按孔板布局依次加入標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控樣與待測樣品(每孔體積依說明書，如50μL)；隨后加入酶標(biāo)物(如50μL)，立即加蓋封板膜，避免蒸發(fā)與污染。
孵育?
在恒溫?fù)u床或酶標(biāo)儀配套孵育箱中，按設(shè)定溫度(通常37℃)與時間(如30 min)孵育，期間避免強光直射。
洗滌?
棄去孔內(nèi)液體，用洗液注滿每孔，靜置30 s后拍干，重復(fù)3–5次，去除未結(jié)合物。
顯色與終止?
加入底物液(如TMB)，避光孵育10–15 min；加入終止液(如2M H?SO?)后立即混勻，終止反應(yīng)。
讀數(shù)與分析?
用酶標(biāo)儀在450 nm(參考波長630 nm)讀取吸光度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品濃度，質(zhì)控樣需在允許范圍內(nèi)方為有效。
四、注意事項?
全程使用一次性槍頭與手套，防止交叉污染。
樣本提取液若出現(xiàn)渾濁或分層，應(yīng)再次離心或過濾。
顯色時間應(yīng)嚴(yán)格控制，過長或過短都會影響OD值。
每批次檢測設(shè)空白孔、陰性對照與陽性對照，確保試劑盒性能正常。
甲哨唑檢測試劑盒的樣本前處理與加樣流程是保證檢測靈敏度和特異性的核心環(huán)節(jié)。嚴(yán)格執(zhí)行SOP、做好質(zhì)控記錄，可有效降低假陽/假陰風(fēng)險，為食品安全與化妝品監(jiān)管提供可靠技術(shù)支撐。
